实验性毕业论文范例_基础医学_医药卫生_专业资料。学号: 泰 山 医 学 院 毕业设计（论文） 题目： 蜂胶黄酮抗 H2O2 PC12 细胞 凋亡机制的研究 院（部）系 药学院 所学专业 药学 年级、班级 完姓名 指导教师姓
学号: 泰 山 医 学 院 毕业设计（论文） 题目： 蜂胶黄酮抗 H2O2 PC12 细胞 凋亡机制的研究 院（部）系 药学院 所学专业 药学 年级、班级 完姓名 指导教师姓名 专业技术职称 2013 年 6 月 18 日 论文原创性书 我所提交的论文都是自己完成，如有抄袭、剽窃、雷同等现象， 愿承担相应后果，接受学校的处理。 专业： 班级： 签名： 20 年 月 日 摘要 目的 观察蜂胶黄酮对过氧化氢（H2O2）大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）凋亡 的影响及机制。 方法 培养 PC12 细胞，取对数生长期细胞分为五组，空白对照组、模型组、蜂胶黄酮 高、中、低剂量组，剂量分别为 200mg/L、100 mg/L、50 mg/L.药物预处理 2h 后，孵育 H2O2 （140μmol/L）24h 过氧化损伤。TUNEL 试剂盒检测原位细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞 内活性氧水平以及细胞周期，ELISA 检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量。 结果 TUNEL 细胞凋亡染色显示, H2O2 组与空白对照组比较染色明显加深,而蜂胶黄酮 组染色明显变浅，说明蜂胶黄酮能对抗 H2O2 细胞凋亡；周期结果显示 H2O2 组处于 G0/G1 细胞明显增多，而处于 G2/M、S 期细胞明显减少，细胞增殖降低，而蜂胶黄酮增加 S 期细 胞促进细胞增殖；与空白对照组相比 H2O2 组活性氧水平、细胞内 Caspase-3 含量明显增高， 而蜂胶黄酮各剂量组活性氧水平降低，Caspase-3 含量减少。 结论 蜂胶黄酮对 H2O2 诱发 PC12 神经细胞凋亡有显着的作用，其机制可能其影响 细胞周期、清除氧基、降低凋亡因子 Caspase-3 有关。 关键词 蜂胶黄酮；PC12 细胞；H2O2;Caspase-3；细胞凋亡 Abstract Objective:?To observe the protection of?propolis flavonoids?on rat with injuried pheochromocytomacells(PC12) induced by??hydrogen peroxide(H2O2)?and to explore its possible mechanism. Methods:???Culture?PC12 cells,the cells in?the logarithmic growth phase were?divided into five groups,blank control group,model group,propolis flavone?of high,medium and low dose group,the dose of 200mg/L,100 mg/L,50 mg/L.?After 2h 0f?Pharmacological preconditioning,the cells?were incubated with H2O2(140 μ mol/L)?for?24h?to induce?oxidative damage.?TUNEL Kit?is used for?determining Cell apoptosis,Flow cytometry was used to detect the intracellular ROS level and cell cycle,ELISA is used for determining the concentration of protein Caspase-3 in cells. Results:?Apoptosis of TUNEL cells staining, H2O2 group compared with the control group, staining was deepened, and the propolis flavone group was significantly lighter, that propolis flavonoids can antagonize the apoptosis induced by H2O2 Cycle showed that H2O2 group in G0/G1 cells were increased, and in the G2/M,S phase cells decreased significantly, reduced cell proliferation, and propolis flavonoids increased S phase cells promoting cell proliferation; compared with the blank control group, caspase-3 in H2O2group, the levels of reactive oxygen species in cells increased significantly, while the propolis flavone in all dose groups decrease the levels of reactive oxygen species, reduced caspase-3 content. Conclusion: Propolis flavonoids on H2O2-induced PC12 cells damage a significant protective effect,The mechanism may be its effect on cell cycle, scavenging oxygen free radicals, decrease the apoptosis related ctor caspase-3. Key words: Propolis; flavonoids; PC12 cells; H2O2; apoptosis 目录 正文………………………………………………………………………………………………01 1 前言…………………………………………………………………………………………01 2 仪器与试剂…………………………………………………………………………………01 3 实验方法……………………………………………………………………………………02 3.1 蜂胶总黄酮的提取与含量测定………………………………………………………02 3.2 PC12 细胞的培养及分组给药…………………………………………………………02 3.3 TUNEL 细胞凋亡原位检测………………………………………………………………02 3.4 流式细胞仪检测细胞周期……………………………………………………………02 3.5 流式细胞仪检测细胞内活性氧水平…………………………………………………03 3.6 ELISA 试剂盒检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量……………………………………03 4 实验结果……………………………………………………………………………………03 4.1 TUNEL 细胞凋亡原位检测……………………………………………………………03 4.2 流式细胞仪检测细胞周期……………………………………………………………04 4.3 流式细胞仪检测细胞活性氧水平……………………………………………………05 4.4 ELISA 检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量……………………………………………06 5 讨论………………………………………………………………………………………07 6 结论………………………………………………………………………………………08 参考文献………………………………………………………………………………………09 文献综述………………………………………………………………………………………10 致谢……………………………………………………………………………………………15 ?蜂胶黄酮抗 H2O2 PC12 细胞凋亡机制的研究 学生：*** 指导教师：*** 1 前言 （泰山医学院药学院，泰安 271016） 老年性痴呆 (Alzheimer′s disease, AD) 是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力 受损为主的中枢神经系统退行性疾病。该病严重中老年人的健康，对社会和经济造成 巨大压力。因此，研究 AD 发病机制及寻求有效药物防治已成为目前世界医药界的热点和难 点。氧化应激损伤神经元在神经退行性病变中具有重要的病因学意义。研究表明老年性痴 呆与氧化应激损伤密切相关。H2O2 是和氧化应激反应密切相关的活性氧之一，它参与了许多 神经系统疾病的发病，与多种疾病如自身免疫病，肿瘤，炎症以及细胞凋亡的发生有关， 长期用作神经细胞氧化损伤的剂。 蜂胶(Propolis) 被誉为“紫色黄金”，是蜜蜂从植物新生枝嫩芽或花蕾处采集的树脂 类物质，掺入其舌腺及蜡腺分泌物，经蜜蜂反复混合而成的胶状物质。蜂胶富含多种具有 药用价值的活性成分，其中主要是黄酮类化合物。本课题组前期研究发现蜂胶醇提物对东 莨菪碱、亚硝酸钠、三氯化铝的小鼠学习记忆障碍模型具有明显作用，对 D-半乳 糖衰老模型小鼠学习记忆功能也有作用，其作用机制可能与其对抗小鼠体内过氧 化反应有关[1-2]。通过 MTT、流式细胞术等前期研究也发现蜂胶黄酮能有效的 H2O2 的 PC12 细胞损伤，提高细胞存活率，细胞凋亡，为进一步研究其抗痴呆作用奠定了基 础。 PC12 细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，在细胞形态，结构，功能上与多巴胺神经元 有许多相似特征，能够表达多巴胺转运体，是体外神经细胞损伤及作用研究使用最为 广泛的细胞系。 本实验拟培养大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞 PC12 细胞株，以 H2O2 神经细胞损伤， 蜂胶黄酮干预， TUNEL 染色观察蜂胶黄酮的抗凋亡作用，并通过检测细胞周期、活性氧及 Caspase-3 对蜂胶黄酮的抗凋亡机制进行研究。 2 仪器与试剂 2.1 材料和试剂 蜂胶原胶，购自实验种蜂场；PC12 细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株），购自 南京凯基生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、PBS,购自于索莱宝；完全 DMEM 培养基、新生牛血清(NBS)，购自于南京凯基生物技术有限公司；TUNEL 细胞原位凋 亡测定试剂盒、活性氧试剂盒及细胞周期检测试剂盒（购自于南京凯基生物技术有限公司）、 ELISA 试剂盒（蓝基生物技术有限公司）。其它试剂均为分析纯。 2.2 仪器 二氧化碳孵箱（Thermo）；单人双面超净工作台（SW-CJ）；倒置式生物显微镜（XDS-1B）； 酶标仪（Infinite f200）；流式细胞仪（FACSCalibur）；高速离心机（TGL-16G）；数控超 声波清洗器（KQ-600DB）；旋转蒸发仪（RE-52A 上海亚荣生化仪器厂）、恒温干燥箱（施都 宝 Bao-80A）、恒温水浴锅(HW.SY21-K)、超低温冰箱（Thermo）。 3.实验方法 3.1 蜂胶黄酮的提取与含量测定 取蜂胶 50g 粉碎，用 85%乙醇浸泡 4 天，配料比蜂胶（g）：85%乙醇（ml）为 1:30，在 30℃条件下超声 50min 后，旋转蒸发仪蒸发成浸膏状，冰箱 4℃内保存备用。以芦丁为标 准品，得标准曲线，计算蜂胶中黄酮含量为：4.86mg/g。 3.2 PC12 细胞的培养及分组给药 在 37℃，恒湿的 5%CO2 细胞培养箱内培养 PC12 细胞，完全培养基为高糖 DMEM 培养基中 含 10%新生小牛血清，加入 100 μg/ml 链霉素和 100 μg/ml 氨苄青霉素。细胞为上皮样贴 壁生长，每 2～3 d 传代 1 次，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为五组：空白对照组、 模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂量组。加药前先将蜂胶黄酮溶于 DMSO 中，再用完全培养基 稀释，使药物终浓度为 200 mg/L、100 mg/L、50mg/L，DMSO 终体积为 1‰，空白对照组及 模型组加入含 1‰DMSO 完全培养基。药物预处理 2h 后，再加入 H2O2 培养 24h，24h 后检测 各项指标。 3.3 TUNEL 细胞凋亡原位试剂盒检测 细胞以 2×105 个/孔接种量接种于 24 孔带爬片的培养板上，药物分组处理后，取出爬片， 自然晒干后用 4%多聚甲醛室温固定 20-30min，PBS 漂洗三次，每次 5min，1%TritionX-100 通透 5min，PBS 漂洗，3% H2O2 封闭 10min，PBS 漂洗吸干，每个样本滴加 50μlTdT 酶反 应液，加盖玻片放入温盒，37℃避光反应 60min，PBS 漂洗吸干，加 5oμlStreptavidin-hrp 工作液，加盖玻片放入温盒，37℃避光反应 30min，PBS 漂洗吸干，加 50μlDAB 工作液， 反应 5min，显微镜下观察，拍照。 3.4 流式细胞仪检测细胞周期 细胞以1×106个/孔的接种量接种于6孔培养板上。药物分组处理后，加入不含EDTA的 胰酶消化，加培养基终止消化，PBS冲洗2次，加入2ml-20℃预处理12h的70%乙醇固定24 小时后，离心5min（小于1000r/min），弃去乙醇，每管加入PBS洗两遍，将细胞混悬后离心 5min（小于1000r/min），按照1:50的RNaseA和PBS，37℃恒温水浴锅水解30min，过20目细 胞筛于流式管内，加入5μl PI染色10-15min，流式细胞仪测细胞周期。通常用细胞增殖指数 PI( pro liferation index)作为衡量细胞增殖的指标，PI即指处于DNA 合成期及有丝期的 细胞在全部细胞中所占比例，公式表示为: PI= [ ( S+ G2 /M ) / ( G0 /G1 + S+G/M) ]*100% 3.5 流式细胞仪检测细胞内活性氧 细胞以 1×106 个/孔接种量接种于 6 孔培养板上，药物分组处理后，加入不含 EDTA 的 胰酶消化，加培养基终止消化，提取细胞，PBS 离心冲洗 2 次，收集于流式管中，离心 5min （1000r/min），按照 1:1000 有用无血清的培养基稀释 DCFH-DA，去 PBS 加入稀释好的 DCFH-DA，37℃孵育 20min，3-5min 摇匀一次使充分安装探针，PBS 洗三次，流式仪测细胞 内氧基含量。 3.6 Elisa 检测 Caspase-3 细胞以 1×106/孔的接种量接种于 6 孔培养板上。药物分组处理后，加入不含 EDTA 的 胰酶消化，加培养基终止消化，提取细胞,PBS 洗三次，加微量 PBS 反复冻融三次，每次半 小时，使细胞离解，细胞液检测 Caspase-3 含量，取试剂盒至于室温平衡 30min，再取酶 标板按照标准品的次序加 50μl 于空白孔，空白孔加 50μl 样品，空白 50μlPBS，在每个空 加 100μl 酶标记溶液（不含空白孔），封口 37℃培养箱孵育 1h（时间可适当延长），反复充 分洗 5 次，拍干，各加 50μlA.B 显色剂，避光 37℃孵育 15min，加 50μl 终止液，450nm 检 测 OD 值。 4 实验结果 4.1 蜂胶黄酮对细胞凋亡的影响 蜂胶黄酮作用 2h 后加入终浓度为 140μmol/L H2O2 作用 24h 后做 TUNEL 原位细胞凋亡染 色，结果图 1 所示，蜂胶黄酮组颜色明显低于 H2O2 损伤组，说明蜂胶黄酮的凋亡率比模型 组明显降低。 图 1 TUNEL 染色观察蜂胶黄酮对 H2O2 损伤作用 (A 空白对照组×200 B H2O2 损伤组×100 C 蜂胶黄酮组×100) 4.2 流式细胞仪法检测细胞周期 与空白组比较，给予 H2O2 后，G0/G1 期细胞明显增多，G2/M、S 期细胞明显减少（P＜0.01), 细胞增殖降低，而蜂胶黄酮组 G0/G1 期细胞明显减少，G2/M、S 期细胞明显增多，说明蜂 胶黄酮具有促进细胞增殖（P＜0.05)。其中蜂胶黄酮组 S 期细胞增加较多，说明蜂胶黄酮可 能会促进细胞有丝。结果见表 1、图 2。 表 1 蜂胶黄酮对细胞周期的影响 分组 空白对照组 模型组 （H2O2140μmol/L） 蜂胶高剂量组 （ 200 mg/L） 蜂胶中剂量组 （ 100 mg/L） G0/G1 47.62±3.2** 63.34±2.5 54.61±1.62** 57.85±1.23* G2/M 17.31±1.71** 10.75±0.98 8.97±0.84 9.92±1.11 S 35.07±2.51** 23.42±3.55 增殖指数（PI） 52.38±3.22** 34.17±3.81 34.48±1.54** 45.39±1.61** 32.17±1.40* 41.15±1.23* 蜂胶低剂量组 （ 50 mg/L） 61.83±1.00 8.89±1.79 29.29±1.04 38.18±2.42 图 2 蜂胶黄酮对细胞周期的影响 （A 空白组 B 模型组 C 蜂胶黄酮高剂量组 D 蜂胶黄酮中剂量组 E 蜂胶黄酮低剂量组） 4.3 蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响 与空白组比较，给予 H2O2 后，细胞内活性氧水平明显提高（P＜0.05),而蜂胶黄酮各剂 量组能明显降低细胞内活性氧水平（P＜0.01)，且具有剂量依赖性，结果见表 2、图 3。 图 3 蜂胶黄酮 氧水平的影响 （A 空白组 B 黄酮高剂量组 剂量组 E 蜂胶 组） 4.4 蜂胶黄 内 蛋白含量 表 2 蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响(?x±s, n=3) 注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。 组别 活性氧( mg/ml ) 空白组 模型组 （ H2O2140μmol/L） 蜂胶黄酮高剂量组 （ 200 mg/L） 蜂胶黄酮中剂量组 （ 100 mg/L） 蜂胶黄酮低剂量组 （ 50 mg/L ） 76.36±1.83** 171.79±24.01 82.75±14.73** 103.27±15.20** 151.96±26.70* 对细胞内活性 模型组 C 蜂胶 D 蜂胶黄酮中 黄酮低剂量 酮对细胞 Caspase-3 的影响 与空白 组比较，给 予 H2O2 后，细胞内 Caspase-3 蛋白含量明显提高（P＜0.05),而蜂胶黄酮各剂量组能明显降 低细胞内 Caspase-3 蛋白含量（P＜0.01)，说明蜂胶黄酮可凋亡因子的产生。结果见表 3。 表 3 蜂胶黄酮对细胞内 Caspase-3 蛋白含量的影响(?x±s, n=3) 组别 Caspase-3( ng/ml ) 空白组 模型组 （ H2O2140μmol/L） 蜂胶黄酮高剂量组 （ 200 mg/L） 蜂胶黄酮中剂量组 （ 100 mg/L） 蜂胶黄酮低剂量组 （ 50 mg/L ） 7.74±3.09** 34.63±1.19 13.98±4.13** 25.56±3.19** 29.79±2.46* 注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。 5 讨论 PC12 细胞在细胞生物学特征上和某些神经元在发生上都源自神经嵴细胞，因此在国内 外广为用作研究神经细胞的模型[3]。H2O2 对细胞的损伤是通过在代谢过程中产生活性氧 （ROS），ROS 再引发一些氧化毒性产物的细胞毒作用损伤细胞[4]。本实验通过 H2O2 损伤 PC12 细胞，蜂胶黄酮作用细胞，TUNEL 细胞凋亡原位检测染色，流式细胞仪检测细胞活性氧水 平和细胞周期，ELISA 检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量，结果显示，TUNEL 细胞凋亡原位检 测染色，蜂胶黄酮组颜色明显低于模型组且接近空白组，说明蜂胶黄酮各剂量组明显降低 3-OH 断裂的细胞凋亡作用[5、6]。细胞周期检测中，与空白组比较，给予 H2O2 后，G0/G1 期细胞明显增多，G2/M、S 期细胞明显减少,细胞增殖降低，而蜂胶黄酮组 G0/G1 期细胞明 显减少，G2/M、S 期细胞增加,说明蜂胶黄酮具有促进细胞增殖的潜势[7]。通过流式细胞仪 检测细胞活性氧水平，蜂胶黄酮组明显低于模型组且接近空白组，说明有清除细胞内氧自 由基，抗氧化作用；ELISA 检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量，蜂胶黄酮组明显低于模型组 且接近空白组，说明细胞凋亡因子产生，减少细胞凋亡，并且随蜂胶黄酮浓度增大效 果更加明显，所以还具有一定的剂量依赖性。以上实验结果均显示蜂胶黄酮对 PC12 具有明 显的抗凋亡作用。 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核 DNA 的断裂情况，其 原理是生物素标记 dUTP 在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3-OH 末端，并可与连接辣根过氧化酶的链酶亲和素结合，在辣根过氧化酶底物 二氨基联苯胺的存在下，产生很强的颜色反应（深棕色），准确的定位正在凋亡的细胞， 因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或者正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，没有 3-OH 的形成，很少能够被染色[8]。 流式细胞仪检测细胞内活性氧水平，是一种利用荧光探针 DCPH-DA 进行的活性氧检测 的试剂盒，DCFH-DA 本身没有荧光，可以穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的 酶水解生成 DCFH，而 DCFH 不能通过细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内，细胞内 的活性氧使无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF,检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内的活性氧 水平，实验结果显示，模型组细胞活性氧水平明显高于正常组与蜂胶黄酮组，说明 H2O2 可 使细胞过氧化，而蜂胶黄酮的三个剂量组细胞活性氧水平率稍高于正常组，明显低于模型 组，说明蜂胶黄酮对细胞有作用，可清除细胞内氧基水平[9]。 Caspase-3 是调控凋亡最直接的基因，被称为凋亡的执行者，在许多凋亡过程中， Caspase-3 被凋亡信号激活后由其前体形式转变为成熟的酶，介导下游的凋亡效应，在正 常细胞中以酶原形式存在，氧基等刺激因子使线粒体通透性增加，线粒体跨膜电位下 降，细胞色素 C，细胞色素 C 主要激活 Caspase-9，进而激活下游的 Caspase-3，引起 细胞形态的变化如出现皱缩、DNA 裂解、染色体浓缩和凋亡，小体的形成，最终导致细胞 凋亡[10]。 本文结果表明，蜂胶黄酮在抗 H2O2 对 PC12 细胞的凋亡发挥作用的机制可归结为减 少 G0/G1 细胞，增加 G2/M、S 期细胞，而促进细胞增殖；抗氧化、清除氧基作用，与 基直接结合， Caspase-3 蛋白活化。 本研究结果表明蜂胶黄酮具有抗 PC12 神经细胞凋亡作用，为蜂胶黄酮的临床应用和 AD 病的临床治疗提供了极有意义的药理和药物学依据[11、12]。 6 结论 蜂胶黄酮对 H2O2 诱发 PC12 神经细胞凋亡有显着的作用，其机制可能其影响细胞周 期、清除氧基、降低凋亡因子 Caspase-3 有关。 参考文献 [1]王浩,张庆乐,许利军等.蜂胶醇提物对小鼠学习记忆的促进作用 [J].中国蜂业， 2008,59(8):5-6,9. 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Curr Opin Pediatr. 1999, 11(3): 223-228. 文献综述 蜂胶主要成分及药理作用 摘要： 蜂胶中的活性物质主要为类黄酮，研究证明其具有抗氧化、抗炎及心脑血 管；提高免疫力的作用； 抑菌、抗病毒、抗炎作用从而促进伤口愈合和组织修复。此外蜂 胶中的类黄酮物质还有预防肿瘤等药理作用。 关键词：蜂胶；类黄酮；抗氧化；抗菌；抗病毒；增强免疫；抗肿瘤 1 蜂胶的来源及其化学成分 蜂胶是工蜂从植物的新生支条、叶、芽或树皮等组织上采集到树脂状分泌物后混入其 上颚腺等腺体的分泌物和蜂蜡等加工而成的芳香性胶状物，含有与胶原植物相类似的大量 有效成分。蜂胶的化学成分很复杂，我国蜂胶成分主要含有三类，酚酸及醛类、黄酮类、 酚酸酯类；含有大量的黄酮类、萜烯类化合物是蜂胶的重要特征，现已从蜂胶中分离鉴定 的黄酮化合物有30余种，包括白杨素、柚柏杨素、芹菜素，金合欢素、槲皮素、高良姜素、 芦丁、山萘酸、山萘甲黄素、鼠李素、松属素等，其5，7-二羟基-3，4-二甲黄酮和5-羟基4， 7-二甲氧基双氢黄酮是蜂胶的特有成分，蜂胶大部分的生理及药理功能都与此类化合物有 密切关系。蜂胶所含有的丰富的黄酮类、萜烯类物质是蜂胶的最大特点。它赋予蜂胶许多 奇妙而独特的生物学作用。蜂胶成分复杂、作用广泛,让科学家感到惊奇,人工无法合成类似 的产品。 2 蜂胶的药理作用 蜂胶具有抗氧化、抗炎、预防动脉粥样硬化、降血糖、抗肿瘤、免疫调节抑菌等多种 生物学活性，体内外实验验证蜂胶及其主要活性成分生物学活性作用的机制是近年来 研究的热点。 2.1 抗氧化作用 已知有许多常见的疾病，如癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、 关节炎等，都被认为与基相关。蜂胶中含有大量的抗氧化活性成分，关于蜂胶抗氧化 的研究从未间断过。蜂胶能2,2’-偶氮（2-脒基丙烷）二盐酸盐的人红细胞氧化 溶血现象和脂质过氧化，有效溶血红细胞膜，使红细胞中脂质过氧化的分解产物丙二 醛水平降低，且呈现时间和剂量依赖性[1]。蜂胶能有效低密度脂蛋白的脂质过氧化和 酪氨酸硝基化，减少内皮型一氧化氮合酶的表达，内皮细胞还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧 化酶的活性，说明蜂胶是通过增加血管内皮细胞中一氧化氮的生物利用度而发挥潜在的心 血管作用的[2]。 2.2 抗炎作用 蜂胶对血管内皮细胞的影响具有剂量依赖性，低浓度的蜂胶能血管内皮细胞，而 高浓度蜂胶却会血管内皮细胞凋亡，具有细胞毒性。在去除血清和生长因子的条件下， 高剂量的蜂胶能线粒体膜电位，是潜在的凋亡剂，而低剂量的蜂胶能显着降低膜 整连蛋白β 4、PC-PLC、P53和ROS水平，血管内皮细胞。在脂多糖（LPS）的血管 内皮细胞中，蜂胶能降低TLR4的表达和PCPLC的活性，进而下游信号NF-Kb p65、 p53、ROS和NO的水平，LPS的血管内皮细胞损伤。在ox-LDL的血管内皮细胞损 伤条件下，蜂胶均能降PC-PLC的活性和ROS的水平，ox-LDL的血管内皮细胞损伤。 有研究发现，蜂胶水提取物对海绵植入小鼠的血管生成、炎症细胞聚集和内源性细胞因子 能产生影响，表明蜂胶的抗炎症和抗血管生成作用与细胞因子调控有关[3]。 2.3 预防动脉粥样硬化 蜂胶乙醇提取物可有效增加高密度脂蛋白胆固醇，减少动脉粥样硬化的风险。将3H- 胆固醇载货巨噬细胞经腹膜内注入到灌服蜂胶乙醇提取物的小鼠体内，可导致血浆、肝脏 和粪便中的高密度脂蛋白胆固醇和腹膜巨噬细胞3H-胆固醇显着增加，肝脏蛋白质三磷酸腺 苷结合盒转运体A1和三磷酸腺苷结合盒转运体G1表达增加。细胞株HepG2和RAW264.7的体外 实验也了上述结果。这些研究表明，蜂胶乙醇提取物增强胆固醇的逆向转运可能是由 于蜂胶乙醇提取物刺激血浆高密度脂蛋白水平和肝三磷酸腺苷结合盒转运体A1和三磷酸腺 苷结合盒转运体G1表达所致[4]。 2.4 降血糖作用 利用链脲霉素构建1型糖尿病大鼠模型，链脲霉素+高脂饲料构建2型糖尿病大鼠模型， 研究蜂胶改善糖尿病肾病可能的作用机理。结果发现，蜂胶能有效改善1型糖尿病和2型糖 尿病对大鼠造成的损伤。蜂胶均能糖尿病大鼠体重下降，改善大鼠血液糖代谢、脂质 代谢、蛋白代谢以及血液、肝、肾氧化应激[5]。通过测定肝肾功能相关指标及组织切片观 察，结果表明蜂胶能改善糖尿病大鼠肝肾功能。蜂胶的效果发现，蜂胶对血糖的控制效果 和肝脏的效果、改善氧化应激的效果都很强。对维持糖尿病大鼠血糖稳定和防止骨骼 发生变化具有显着作用。 2.5 抗肿瘤作用 蜂胶中含有丰富的抗癌物质。研究证明，癌症患者在服用蜂胶后，可缩小癌细胞且能 减轻化疗、?放疗引起的副作用。目前，蜂胶中癌细胞的成分已被鉴定出来，主要是 caffeic?acid类的衍生物，在1988年Grunberger等人便发现caffeic?acid?phenethyl?este（r CAPE） 对细胞具有选择性的毒杀作用。CAPE可以致癌基因的表现，可以这些不正常细胞 进行细胞凋亡作用（apoptosis），对正常的细胞则否[6]。对於受到致癌物质转型的不正 常细胞，CAPE同样也可以使它们产生细胞凋亡作用。 2.6 免疫调节活性 蜂胶能明显同种异体CD4 T细胞的增殖，激活和这些同种异体CD4 T细胞中 IL-2、IFN-γ 和IL-17的表达。蜂胶能选择性地增殖T细胞的凋亡，抗增殖作用是可逆 的，也适用于活化的T细胞。蜂胶可用于移植物抗宿主病的免疫剂[7]。 2.7抑菌作用 蜂胶乙醇提取物对外阴念珠菌具有抗真菌活性，为外阴念珠菌病的治疗和预 防提供了重要信息[8]。蜂胶对Trichophyton violaseum、Triehophyton tonsorans和 Epidermophyton flucosum 3种皮肤癣菌有很好的抗真菌作用。巴西绿蜂胶提取物能头 癣和花斑癣，其作用效果堪比达克宁，可作为替代药用于治疗癣菌病。抑菌活性的研究拓 展了蜂胶的应用范围。 另外吕泽田等报道了蜂胶中黄酮类化合物肿瘤作用的试验与应用，结果表明高剂 量治疗组小鼠瘤的率为30％；中剂量组小鼠腹腔巨噬细胞率及各剂量指数显 着高于对照组；高、中剂量组小鼠的脾脏（NK）自然杀伤细胞活性（%）亦显着高于对照 组。韩连堂等报道蜂胶对移植的小鼠S180肉瘤、肝癌具有明显的作用，其可能的抗癌机 制包括：（1）抗氧化作用；（2）减少致癌物的合成、吸收和活化；（3）对细胞的分化、增 殖、基因表达的影响；（4）对DNA损伤与修复的作用；（5）促进癌细胞凋亡；（6）对细胞 的连接通讯的作用；（7）对机体免疫功能的作用。张建等对蜂胶提取物进行体外抗肿瘤实 验，结果表明：山东蜂胶乙醇提取物和提取物在体外对肿瘤细胞均具有较强的作 用。蜂胶乙醇提取物肿瘤细胞凋亡的研究表明，肿瘤细胞经蜂胶处理后，细胞形态呈 现固缩，核染色质固缩致密，DNA 电泳分析显示特征的梯度形图谱；流式细胞仪检测细胞 周期，凋亡峰增高，且G0-G1与C2－M期百分比增高，凋亡控制基因bel-2 基因表达的同时， 激活了凋亡相关基因，启动了细胞凋亡过程，表明蜂胶抗肿瘤作用是通过诱发细胞凋亡实 现的[9]。韩连堂等应用Ames试验分别检测蜂胶对环磷酰胺、叠氮钠、正定霉素、2-氨基芴 诱发突变的作用，结果显示：蜂胶对4种诱变剂的不同类型的基因突变均产生作用， 证明蜂胶具有广谱的抗诱变作用，其基因突变的作用机制可能是对基因突变过程中的 多个环节产生作用而显示其抗诱发活性。 蜂胶除了具有上述的保健作用外，还有抗病毒、护肝、抗疲劳、调节血脂、改善 代谢等作用。 3 蜂胶的临床应用 蜂胶具有抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗炎、降血压、增强免疫力等作用。在很多国家蜂 胶被作为民间药物使用。 3.1 对糖尿病的治疗作用 糖尿病是最常见的慢性病之一, 在中国的发病率达到2%, 发病机理为胰岛素绝对或相 对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素性降低, 引起蛋白质、脂肪、水和电解质等一系 列代谢紊乱综合症。目前, 世界上还没有一种药物可以根治糖尿病。蜂胶中含有胰蛋白酶 等多种活性酶和其他抗病毒物质, 对恢复胰脏机能有明显的作用, 同时, 蜂胶中含有的B 族维生素, 又可能成为胰脏制造胰岛素的料。如果蜂胶与蜂王浆合用, 对糖尿病会有更好 的疗效。 3.2 增强免疫力 在影响人体健康的诸多因素中, 自身免疫功能失调, 是最核心、最本质的因素。蜂胶 通过调节人体生理功能, 激发免疫细胞活力和自然杀伤细胞活性, 促使丙种球蛋白增长, 增加抗体产量, 显着增强免疫能力, 在人体内培育抗病力与自愈力。蜂胶增强免疫功能体 现在免疫防御、免疫自稳、免疫三方面, 即机体对病菌、病毒的抗感染能力, 识别和 清除自身衰老的组织细胞的能力, 杀伤和清除异常突变细胞、恶性肿瘤生长的能力。 3.3 促进皮肤健康 临床实验表明: 蜂胶对皮肤瘙痒症、神经性皮炎、射线皮炎、日光性皮炎、毛囊炎、 汗腺炎、脂溢性脱发、斑秃、青年痤疮等有效; 对物皮肤病, 如烧伤、烫伤、冻疮、 手足皲裂有效，有促进伤口愈合与黏附伤口的作用。同时, 蜂胶抗菌消炎作用强, 局部止 血止痛快, 能促使上皮组织增生和肉芽生长, 改善皮下组织血液循环, 疤痕形成。同 时蜂胶对皮肤过敏、皮肤搔痒、头皮屑、头皮疹、湿疹、药症均有效果。 3.4 癌症的作用 蜂胶具有抗癌广谱性, 能致癌物质代谢活性, 增强正常细胞膜活性, 分解癌细胞 周围的纤维蛋白, 防止正常细胞癌变或癌细胞转移。同时蜂胶中含有多种对肿瘤细胞生长 有作用的物质, 其中以栎精(槲皮素、五羟黄酮)、咖啡酸苯乙酯、clerda 二萜烯、金 雀异黄酮和菲瑟酮等化合物的作用最强, 这些成分除了对人类的肝癌细胞有作用, 对 人类的宫颈癌细胞和淋巴癌细胞也有作用。亚硝酸胺和黄曲霉素是目前所了解的具有高致 癌力的物质, 蜂胶中的酚类和酸类化合物可以阻断机体内亚硝酸胺的合成, 蜂胶中的黄酮 类化合物可以机体分泌苯芘羟化酶, 以解除黄曲霉素类等致癌物对机体的。 3.5 对胃肠道疾病的作用 对于慢性胃肠炎患者, 常给服抗生素类药物, 以炎症发展。但是, 经常服用化学 合成的抗生素, 容易导致人体消化道寄生菌群比例失调。实验表明: 食用蜂胶, 对慢性胃 肠炎, 效果显着, 而且不会造体消化道寄生菌群比例失调。同时蜂胶具有良好的成膜 性, 能够在粘膜上形成一层酸不能渗透的薄膜。利用蜂胶这一特性, 人们应用它治疗胃及 十二指肠溃疡, 可获得较好的疗效。除了上述临床作用, 蜂胶对更年期障碍也具有调节作 用。因蜂胶具有镇静、麻醉及其他神经系统作用, 使它具备了治疗失眠、止痛及各种神经 系统疾病的功效。此外, 蜂胶在预防和治疗龋齿和口腔炎方面效果也很显着。 蜂胶具有广泛的生理及药理功能,开发前景极为广阔, 拟被列为世界卫生组织营养与 保健计划内的一种保健品。随着人们对其认识和研究的深入, 经过足够时间的考查, 蜂胶 以其资源丰富、效果显扬州发改委蒋珊照片着、提取方便等优点, 将会成为很有前途的新药和天然保健品。 参考文献 [1]芬;蜂胶的研究进展[J];医药;2002年03期：227-229 [2] Valente MJ, Baltazar AF, Henrique R, Estevinho L, Carvalho M.Biological activities of Portuguese propolis: Protection against freeradical-induced erythrocyte damage and inhibition of human renalcancer cell growth in vitro[J].Food Chem Toxicol, 2011, 49: 86-92. 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